## 人肝癌细胞HepG2培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人肝癌细胞HepG2

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：建议第一次传代比例为1:2。传代后，每两天更换培养基。

备注：使用无菌离心管收集培养基，以备后续对比培养。如对比效果不理想，请直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后处理

为确保运输细胞的最佳状态，请在收到细胞后，将其培养至良好状态，并使用完全培养液填满瓶口并封好。收到细胞后，使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，然后放置在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，使细胞状态稳定后再进行处理。观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（推荐40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重发的重要依据，若未提供照片，则默认状态良好。注意，在将密封的培养瓶放入培养箱时，请将瓶盖稍稍拧松。传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自制的完全培养基，以便进行对比培养。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代：

若细胞汇合度未超过80%，将培养液收集至离心管中，并保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；若汇合度超过80%，则可以进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃孵箱中消化1-2分钟。在显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使细胞完全脱落后吸出，再将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存：

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗一次细胞。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，轻轻摇动后观察细胞，待其回缩变圆后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃的冰箱保存。如需转入液氮罐，请在-80℃冰箱中保存24小时以上再进行转移。

c、细胞复苏：

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），快速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无冰晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，轻轻用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶内，并放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项：

在运输过程中，某些细胞可能会因为附着不牢而脱落，这是正常现象。对此，可以依照以下步骤操作：将培养瓶内的培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养（后期可作为对比培养），沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后，再加入5ml完全培养基以终止反应。随后的步骤同样进行离心和重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，将其放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

五、售后条款：

1）关于细胞出现问题的重发情况及判断标准：

1. 在运输过程中遇到细胞丢失、瓶身破损、培养液漏液等问题，均可重发。
2. 如收到细胞后48小时内发现污染，请提供真实实验结果，核实后可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，或干冰冻存发货的细胞在复苏后24小时内，如果绝大多数细胞未存活（需提供真实且清晰的细胞状态照片），则可重发。
4. 干冰冻结发货的细胞在复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后且未开封，若出现污染现象，可重发。
5. 关于细胞活性问题，请在收到产品7天内提供真实实验结果，可使用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，确认后可重发。
6. 收到细胞的当天以及第2、3天请拍照，若未告知，视为产品合格。4-7天内出现问题时，需提供收到细胞前3天的照片、出现问题时的照片及相关操作详细步骤，经过技术人员沟通确认后，若判断为我方责任则可重发，若双方承担责任，则协商处理或按合同价的50%收费进行重发。

2）不予重发的情况：

1. 客户因个人原因导致的细胞污染，不重发。
2. 客户操作不当导致的细胞状态不佳，不重发。
3. 使用非本库推荐的培养体系导致的细胞状态不佳，不重发。
4. 细胞状态不良且未提供细胞培养前3天的照片，不重发。
5. 细胞培养时经过其他处理的，不重发。
6. 收到细胞后2天内未告知的不予重发。
7. 视具体情况而定。

通过使用尊龙凯时的细胞培养产品和服务，确保您的实验成功和细胞健康。